2.1 Isolasi DNA kromosom bakteri

LANDASAN TEORI

Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn dinding sel, lsiis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse.

Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA kromosom bakteri

BAHAN DAN ALAT

  1. Strain bakteri sampel
  2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair
  3. Bufer Sodium Tris-EDTA (STE)
  4. Lisozim
  5. Buffer lisis
  6. CI (kloroform Isoamil alkohol)
  7. Fenol
  8. Na asetat
  9. Etanol absolut
  10. Etanol 70%
  11. Buffer TE
  12. akuades
  13. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)
  14. Microsentrifuga (dingin)
  15. Tabung mikrosentrifuga
  16. Sarung tangan
  17. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
  18. Lemari pendingin
  19. Kertas tisu
  20. Kamera Digital

CARA KERJA

Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode lysis alkali (Wang).

  1. Kultur semalam bakteri dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB cair. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).
  2. Sebanyak 3 ml kultur hasil inkubasi 16 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
  3. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri, kemudian pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
  4. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama satu jam.
  5. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis, diresuspensi dengan cara dibolak-balik.
  6. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah 100 µl CI dan 100 µl fenol dingin, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
  7. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga dan diperkirakan besar volemenya.
  8. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
  9. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung mikrosentrifuga yang baru dan diperkirakan besar volemenya.
  10. Supernatan tersebut ditambah Na asetat dan etanol absolut masing-masing sebanyak 0,1 volume supernatan dan 2x volume supernatan.
  11. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu -20 0C selama 2 jam.
  12. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
  13. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
  14. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 µl TE dan diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri.

HASIL

Amatilah hasil isolasi DNA kromosom bakteri dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA kromosom yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

Leave a Reply

Please log in using one of these methods to post your comment:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

Follow

Get every new post delivered to your Inbox.

%d bloggers like this: