2.2 Isolasi Plasmid

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

TUJUAN

Mengisolasi  DNA plasmid pUC19 dari sel inang E. coli menggunakan Qiaprep Kit

BAHAN DAN ALAT

  1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19
  2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair
  3. Ampisilin
  4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)
  5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
  6. Tabung mikrosentrifuga
  7. Sarung tangan
  8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
  9. Lemari pendingin
  10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

  1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).
  2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
  3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
  4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.
  5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.
  6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.
  7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.
  8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit.
  9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit.
  10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga.
  11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.
  12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.
  13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.
  14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).
  15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

HASIL

Amatilah hasil isolasi DNA palsmid dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA plasmid yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

Leave a Reply

Please log in using one of these methods to post your comment:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: