5. Analisis Restriksi DNA

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

  1. Plasmid pUC19
  2. Enzim restriski (PstI)
  3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
  4. Tabung mikrosentrifuga
  5. Sarung tangan
  6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
  7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
  8. termometer
  9. Lemari pendingin (Frezer)
  10. Kamera Digital

CARA KERJA

  1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI.
  2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI
  3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.
  4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.
  5. tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).
  6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.
  7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.

HASIL

Amatilah hasil pemotongan DNA palsmid dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA plasmid yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

Leave a Reply

Please log in using one of these methods to post your comment:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: